本发明属海洋微藻养殖领域，涉及一种牟氏角毛藻培养基配方及白塑料桶充气培养方法。牟氏角毛藻是一种小型海洋硅藻，富含多不饱和脂肪酸、蛋白质等，是对虾、鲍鱼等海珍品的优质育苗饵料。目前牟氏角毛藻生产上多采用f/2培养基配方进行培养，存在问题是营养物质不均衡，不全面，生长缓慢、倍增时间长、产量低。我的实验显示，用尿素取代硝酸盐作氮源并补充NaHCO
1.一种牟氏角毛藻的培养方法，其特征在于步骤如下：xa0配置牟氏角毛藻培养基配方如下：CO(NH₂)₂
21.5mg，FeC₆H₅O₇·5H₂O0.5mg，Na₂SiO₃·9H₂O8mg，NaHCO₃500mg，九二0植物生长刺激素5国际单位，VB₁₂5×10^-4mg，VB₁
0.1mg，VB₆
0.1mg，柠檬酸铁铵1mg，ZnSO₄500mg，体积比1％的钼酸水溶液15ml，硫酸锰5mg，磷酸二氢钾18mg，氯化钾3mg，海水1000mL；xa0所述的牟氏角毛藻培养基的制备方法，包括如下步骤：xa01)因柠檬酸铁较难溶解，加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；xa02)九二0植物生长刺激素为白色结晶粉末，不易溶解于水，先用酒精充分溶解，每克用50毫升酒精或60度白酒溶解1小时以上，再按所需浓度兑水稀释；xa03)加营养盐的过程中需不断搅水，而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；xa04)各种营养盐可先配成浓度较高的母液，再依次添加；xa05)全部营养盐加完后再充气搅拌15分钟，即可接种；xa06)此培养基配方对牟氏角毛藻各级培养阶段都适用；xa0所述牟氏角毛藻培养方法，包括如下步骤：xa0采用白塑料桶充气培养方法；白色塑料桶为市场售常用聚乙烯塑料桶，圆筒形，直径30cm，高60cm，加满水约6.5×10⁴ml，消毒海水洗净，再用蒸馏水润洗3遍，桶口处用酒精擦洗消毒备用；白色塑料桶置于室外水泥地上，顶部有透明玻璃钢瓦遮阴，四周开放式，将白桶放置于离地0.5m的水泥板上，自然光照射，最佳温度25-30℃，最佳光照强度10000-15000lx，或人工光源光照，60～100瓦电灯或日光灯，需1500～3000勒克斯／厘米²；培养用海水采用漂白液(次氯酸钠)氧化法消毒；漂白液氧化法消毒方法是1m³海水中加入漂白液200～300mL，使海水中有效氯含量达到10～20mg/L，充气8～12h后，用硫代硫酸钠中和余氯；硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止；xa0按照上述的牟氏角毛藻培养基配方添加培养基，藻种要选择生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物等；充气培养，接种密度为30×10⁴cell／mL，充入空气和二氧化碳混合气体，体积比比例为V_空气：V_二氧化碳=15：1，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行；用透明薄膜盖于桶上部，然后用橡皮筋拉紧，进行封闭式培养；经过5-7天的培养，密度达300×10⁴-400×10⁴cell/mL即可采收或转入下一级培养；xa0在充气培养时充入空气和二氧化碳、臭氧混合气体，体积比比例为V_空气：V_二氧化碳：V_臭氧=15:1:1。xa0技术领域
本发明属于海洋微藻养殖领域，尤其涉及一种牟氏角毛藻培养基配方及白塑料桶充气培养方法。
背景技术
牟氏角毛藻(Chaetocerosxa0muelleri)隶属硅藻门，中心纲，盒形藻目，角毛藻科，角毛藻属，是一种小型海洋浮游硅藻，细胞小，壁薄，多数单个生活，在10～39℃环境温度下均能生长繁殖，最适温度25～30℃，是一种沿岸性半咸水种类。与其它常用单胞藻如球等鞭金藻(Isochrysisxa0galbanaxa0Parke)、湛江叉鞭金藻(Dicrszhanxa0jiangensis)和扁藻(Platymonas)相比，牟氏角毛藻藻含有大量脂肪酸、蛋白质等营养物质，繁殖快且耐高温。多不饱和脂肪酸含量高，在良好培养条件下，其二十碳五烯酸(EPA)占总脂肪酸含量10.2％，是对虾、海参、文蛤、牡蛎、鲍鱼、魁钳、海胆等海珍品优质育苗饵料，在医药、保健品行业也有重要应用价值。海水中无机碳的存在形式以HCO₃^-为主(90％)，而游离的CO₂不足1％。过去人们一直认为，水体中游离CO₂是藻类利用外源无机碳的唯一形式。张学成的工作表明，螺旋藻培养基中添加50～100mmol/Lxa0NaHCO₃时，不仅可以满足螺旋藻生长的需要，而且有助于保持藻体生长的pH值。林惠民认为，NaHCO₃在培养基中的作用之一是作为碳源。我的研究结果表明，牟氏角毛藻可以利用HCO₃^-作为碳源。另外，氮磷营养盐对牟氏角毛藻的生长影响极显著，氮的影响高于磷。传统上人们习惯利用硝酸钠或硝酸钾作为培养牟氏角毛藻氮源，但我的实验显示，用尿素作氮源牟氏角毛藻生长更快，产量更高。尿素对不同微藻生长影响机理较无机氮复杂。已经证实许多藻含有尿素酶，在酶的催化下，尿素分解出氨被微藻利用。可能是酶功能的差异造成了各种微藻利用氮或磷的能力差异。目前牟氏角毛藻生产上多采用f/2培养基配方进行培养。牟氏角毛藻规模化培养存在的主要问题是营养物质不均衡，不全面，藻细胞生长缓慢、倍增时间长、细胞密度低(室外培养密度最高仅为2×10⁶cell/mL酶，产量低。合适的培养基是实现牟氏角毛藻高密度培养的重要因素之一。以前使用的培养基没有加入碳酸氢钠和维生素及微量元素，但大量实验表明，牟氏角毛藻除了能利用空气中游离的CO₂，还能有效地利用培养液中的HCO₃^-作为碳源。添加NaHCO₃不仅缩短了牟氏角毛藻的倍增时间，而且延长了藻的生长时间。我的实验表明，添加500mg的NaHCO₃和5国际单位九二0植物生长刺激素(即赤霉素)，5×10^-4mgxa0VB₁₂，0.1mgxa0VB₁后，营养更加全面、均衡，能大大提高生长速度，牟氏角毛藻产量能提高87％。贝类人工苗种技术的不断改进和工厂化种苗技术的提高，要求技术人员在生产中能够稳定提供大量单胞藻作为饵料，为解决这个问题，国内外藻类培养工作者做了很多研究，有封闭立柱式、薄膜袋式、开放水泥池式等多种培养方法。生产上现在一般采用玻瓶一级保种，小池或小型薄膜袋或玻璃缸桶二级扩种和大池三级培养，存在很多缺点：易污染、成本高、洗刷困难、操作不便、容易划破等。我用聚乙烯白色塑料桶并充入空气和CO₂混合气体进行牟氏角毛藻二级扩种，并取得了理想效果。CO₂来源广泛，利用CO₂促进微藻细胞的生长，具有良好的经济价值。我的研究证明，将CO₂和空气形成的混合气体(V_CO2∶V_空气＝1∶15)充入藻液，可明显促进牟氏角毛藻的生长，生产量大大高于不充气和只充入纯空气或纯CO₂的平行对照。CO₂对微藻的光合作用及固碳效率的影响机理，已有广泛的研究。用白塑料桶充气培养方法进行牟氏角毛藻二级扩种，大小合适，易于搬动，操作灵活，不易污染，不忌直射光，可封闭式充气，洗刷方便，可以重复使用，不易损坏，不易划破，透光性好，成本低廉，生长快，产量高。
发明内容
为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种牟氏角毛藻培养基配方及白塑料桶充气培养方法，具体技术方案如下：一种牟氏角毛藻培养基，配方如下：CO(NH₂)₂(即尿素)21.5mg，KH₂PO₄8mg，FeC₆H₅O₇·5H₂O(即柠檬酸铁)0.5mg，Na₂SiO₃·9H₂Oxa08mg，NaHCO₃xa0500mg，九二0植物生长刺激素(即赤霉素)5国际单位，VB₁₂5×10^-4mg，VB₁xa00.1mg，海水1000mL。一种牟氏角毛藻培养基，其特征在于该牟氏角毛藻培养基配方如下：CO(NH₂)₂(尿素)21.5mg，KH₂PO₄8mg，FeC₆H₅O₇·5H₂O(柠檬酸铁)0.5mg，Na₂SiO₃·9H₂O8mg，NaHCO₃xa0500mg，九二0植物生长刺激素(即赤霉素)5国际单位，VB₁₂5×10^-4mg，VB₁0.1mg，VB₆xa00.1mg，柠檬酸铁铵1mg，ZnSO₄500mg，体积比1％的钼酸水溶液15ml，硫酸锰5mg，磷酸二氢钾10mg，氯化钾3mg，海水1000mL。一种牟氏角毛藻培养方法，其特征在于包括如下步骤：采用白塑料桶充气培养方法；白色塑料桶为市场售常用聚乙烯塑料桶，圆筒形，直径30cm，高60cm，加满水约6.5×10⁴ml，消毒海水洗净，再用蒸馏水润洗3遍，桶口处用酒精擦洗消毒备用；白色塑料桶置于室外水泥地上，顶部有透明玻璃钢瓦遮阴，四周开放式，将白桶放置于离地0.5m的水泥板上，自然光照射，最佳温度25-30℃，最佳光照强度10000-15000lx，或人工光源光照，60～100瓦电灯或日光灯，需1500～3000勒克斯/厘米²；培养用海水采用漂白液(次氯酸钠)氧化法消毒；漂白液氧化法消毒方法是1m³海水中加入漂白液200～300mL，使海水中有效氯含量达到10～20mg/L，充气8～12h后，用硫代硫酸钠中和余氯；硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止。按照所述的牟氏角毛藻培养基配方添加培养基，藻种要选择生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物等；充气培养，接种密度为30×10⁴cell/mL，充入空气和二氧化碳混合气体，体积比比例为V_空气∶V_二氧化碳＝15∶1，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行；用透明薄膜盖于桶上部，然后用橡皮筋拉紧，进行封闭式培养；经过5-7天的培养，密度达300×10⁴-400×10⁴cell/mL即可采收或转入下一级培养。优选地，充气培养时充入空气和二氧化碳、臭氧混合气体，体积比比例为V_空气∶V_二氧化碳∶臭氧＝15∶1∶1。有益效果：我的实验表明，用尿素代替硝酸钠或硝酸钾作为培养牟氏角毛藻的氮源，并补充500mg的NaHCO₃和5国际单位九二0植物生长刺激素(即赤霉素)，5×10^-4mgxa0VB₁₂，0.1mgxa0VB₁后，营养更加全面、均衡，缩短了牟氏角毛藻的倍增时间，延长了藻的生长时间，能大大提高生长速度，牟氏角毛藻产量能提高87％。用白桶并充入CO₂混合气体方法进行牟氏角毛藻二级扩种，大小合适，易于搬动，操作灵活，不易污染，不忌直射光，可封闭式充气，洗刷方便，可以重复使用，不易损坏，不易划破，透光性好，成本低廉，生长快，产量高。
具体实施方式
培养基配制方法1)柠檬酸铁较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90℃，并不断搅拌至全部融化；2)九二0植物生长刺激素(即赤霉素)为白色结晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解1小时以上)，再按所需浓度兑水稀释。3)加营养盐的过程中需不断搅水，而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；4)各种营养盐可先配成浓度较高的母液，再依次添加。5)全部营养盐加完后再充气搅拌15分钟，即可接种。6)此培养基配方对牟氏角毛藻各级培养阶段都适用。一种牟氏角毛藻培养基，配方如下：CO(NH₂)₂(即尿素)21.5mg，KH₂PO₄8mg，FeC₆H₅O₇·5H₂O(即柠檬酸铁)0.5mg，Na₂SiO₃·9H₂Oxa08mg，NaHCO₃xa0500mg，九二0植物生长刺激素(即赤霉素)5国际单位，VB₁₂5×10^-4mg，VB₁xa00.1mg，海水1000mL。一种牟氏角毛藻培养基，其特征在于该牟氏角毛藻培养基配方如下：CO(NH₂)₂(尿素)21.5mg，KH₂PO₄xa08mg，FeC₆H₅O₇·5H₂O(柠檬酸铁)0.5mg，Na₂SiO₃·9H₂O8mg，NaHCO₃xa0500mg，九二0植物生长刺激素(即赤霉素)5国际单位，VB₁₂xa05×10^-4mg，VB₁0.1mg，VB₆xa00.1mg，柠檬酸铁铵1mg，ZnSO₄500mg，体积比1％的钼酸水溶液15ml，硫酸锰5mg，磷酸二氢钾10mg，氯化钾3mg，海水1000mL。一种牟氏角毛藻培养方法，其特征在于包括如下步骤：采用白塑料桶充气培养方法；白色塑料桶为市场售常用聚乙烯塑料桶，圆筒形，直径30cm，高60cm，加满水约6.5×10⁴ml，消毒海水洗净，再用蒸馏水润洗3遍，桶口处用酒精擦洗消毒备用；白色塑料桶置于室外水泥地上，顶部有透明玻璃钢瓦遮阴，四周开放式，将白桶放置于离地0.5m的水泥板上，自然光照射，最佳温度25-30℃，最佳光照强度10000-15000lx，或人工光源光照，60～100瓦电灯或日光灯，需1500～3000勒克斯/厘米²；培养用海水采用漂白液(次氯酸钠)氧化法消毒；漂白液氧化法消毒方法是1m³海水中加入漂白液200～300mL，使海水中有效氯含量达到10～20mg/L，充气8～12h后，用硫代硫酸钠中和余氯；硫代硫酸钠量由余氯的多少来确定，直到滴入淀粉碘化钾液不变色为止。按照所述的牟氏角毛藻培养基配方添加培养基，藻种要选择生长良好、生活力旺盛、色泽鲜艳、无沉淀及无明显附壁现象的藻种，镜检无其它杂藻、原生动物等；充气培养，接种密度为30×10⁴cell/mL，充入空气和二氧化碳混合气体，体积比比例为V_空气∶V_二氧化碳＝15∶1，充气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；夜间停止充气，白天行间隔充气，即充气1小时，停1小时，重复进行；用透明薄膜盖于桶上部，然后用橡皮筋拉紧，进行封闭式培养；经过5-7天的培养，密度达300×10⁴-400×10⁴cell/mL即可采收或转入下一级培养。优选地，充气培养时充入空气和二氧化碳、臭氧混合气体，体积比比例为V_空气∶V_二氧化碳∶臭氧＝15∶1∶1。最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。